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細(xì)胞復(fù)蘇、傳代與凍存操作流程

更新時間:2023-03-02      點擊次數(shù):976

細(xì)胞復(fù)蘇、傳代與凍存操作流程

儀器與試劑

儀器

試劑

耗材

離心機(jī)

胎牛血清(FBS

離心管(15ml、50ml

生物安全柜

無菌 1×PBS pH=7.2

T-25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶

電動移液器

0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA

一次性無菌移液管(2ml5ml、10ml

CO2 培養(yǎng)箱

wan培養(yǎng)基(含血清)

1.8mL 凍存管

倒置顯微鏡



液氮罐


凍存液:90%FBS+10%DMSO



異丙醇


程序降溫盒

恒溫水浴鍋



超低溫冰箱



護(hù)目鏡、厚毛線手套等

操作流程

復(fù)蘇

1)將恒溫水浴鍋中的水預(yù)熱到 37℃;

2

)準(zhǔn)備一支 15ml 離心管,加入 5ml 10%FBS wan全培養(yǎng)基,放入 37℃水浴鍋中預(yù)熱;

3

)戴上護(hù)目鏡,厚毛線手套后,從液氮罐中取出要復(fù)蘇的細(xì)胞,盡快轉(zhuǎn)入 37℃恒溫水浴鍋中復(fù)溫晃動凍存管以提高復(fù)溫速率;

4

)將融化了的凍存管中的細(xì)胞吸入事先準(zhǔn)中,混勻后,1000rpm 離心 5min

5

)準(zhǔn)備一個 T-25 培養(yǎng)瓶,寫上細(xì)胞名稱、日期,再加入 4ml wan全備的離心管培養(yǎng)基;

6

)離心完成后棄去上清,用 1ml wan全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后,轉(zhuǎn)入 T-25 細(xì)胞培養(yǎng)中,混勻后轉(zhuǎn)入O2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)靜置。



注意:從液氮中取出細(xì)胞凍存管時,若凍存管內(nèi)有液氮進(jìn)入,需擰松凍存管,排出內(nèi)部殘留的液氮,之后擰緊凍存管,置于干冰上,然后放入 37℃水浴中,避免溫差太大造成液氮快速氣化而爆炸。

傳代

(細(xì)胞傳代建議一傳二)

1.

當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到 85%以上時,可進(jìn)行傳代。

2.

在生物安全柜內(nèi),打開培養(yǎng)瓶瓶口,收集瓶內(nèi)的培養(yǎng)基;

3.

向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入 3ml 無菌的 1×PBS  后,水平放置培養(yǎng)瓶,使 PBS 能夠浸潤到培養(yǎng)瓶底面上所有的面積,吸棄 PBS;

4.

向瓶內(nèi)加入消化液 1ml,浸潤底面后放入 37℃ CO2 培養(yǎng)箱中孵育 1~2min;

5.

孵育完成后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否變圓飄起,若全部消化下來則直接向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入2ml 10%FBS 的wan全培養(yǎng)基中,將懸液吸入 15ml 離心管;
注:如還有部分細(xì)胞未消化下來,可采用分步消化:
準(zhǔn)備一個無菌的 15ml 離心管,加入 2ml 10%FBS wan全培養(yǎng)基;
將消化下來的細(xì)胞吸入中的離心管內(nèi)中和(避免吹打);
向之前消化的培養(yǎng)瓶中加入 1ml 胰酶繼續(xù)消化 2min 左右,輕拍培養(yǎng)瓶,95%左右細(xì)胞脫落后加入 2ml 10%FBS 的wan全培養(yǎng)基中和,中和后的細(xì)胞懸液移入中的離心管內(nèi)。
6.1000rpm 離心 5min;

7.

準(zhǔn)備兩個新的 T-25 培養(yǎng)瓶,各加入 4ml wan全培養(yǎng)基。

8.

離心完成后,棄上清,用 2mlwan全培養(yǎng)基重懸離心細(xì)胞,將重懸后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入 2 T-25 培養(yǎng)瓶,每個培養(yǎng)瓶各 1ml

9.

水平放置培養(yǎng)瓶,震蕩混勻后,將培養(yǎng)瓶置于 37℃5%CO2 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。



凍存

(細(xì)胞凍存建議每瓶 T25 凍一支)

1~6

)參照傳代步驟


7)離心完成后,棄上清,用 1mL 凍存液重懸細(xì)胞沉淀,然后轉(zhuǎn)入 1.8ml 凍存管中;

8)將凍存管轉(zhuǎn)入填充滿異丙醇的程序降溫盒中,之后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中過夜降溫;

9)第二天,取出降溫完成的序降溫盒中的凍存管,盡快轉(zhuǎn)入液氮罐中保存。


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